Επίδραση του μελιού και της
πρωτεΐνης1 του βασιλικού
πολτού στις κυτταροκίνες και στους μεταγραφείς του MMP-9 mRNA σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα
　

Juraj Majtan, A. Kumar, Tomas Majtan. Andrew F. Walls, Jaroslav Klaudiny - Αναδημοσίευση από το περιοδικό Πειραματική

Δερματολογία - Μετάφραση Δανάη Γεράρδου, βιολόγος


Tο μέλι έχει χρησιμοποιηθεί από τα αρχαία χρόνια
ως θεραπεία για την επούλωση πληγών. Ωστόσο,
ακόμη και αν τα αποτελέσματα από τυχαίες κλινικές
δοκιμές δείχνουν ότι το μέλι επιταχύνει την επούλω-
ση πληγών, καμία μελέτη δεν έχει πραγματοποιηθεί
για την επίδρασή του στα ανθρώπινα κύτταρα του
δέρματος (επιδερμικά κερατινοκύτταρα και ινοβλά-
στες του δέρματος). Έχουμε αποδείξει ότι τα κερατι-
νοκύτταρα, τα οποία είναι γνωστό ότι εμπλέκονται
 στην επούλωση των πληγών είναι υπεύθυνα για την αυξημένη παραγωγή των μεσολαβητών, των κυτταροκινών (TNF-α, IL-1β και TGF-β) καθώς και της μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (MMP-9) μετά από επώαση με μέλι. Έγινε Realtime PCR για την ποσοτικοποίηση του επιπέδου mRNA επιλεγμένων κυτταροκινών και MMP-9. Επιπλέον, δεί-
ξαμε ότι το αυξημένο επίπεδο της MMP-9 στην επιδερ-
μίδα μετά από επώαση με μέλι οδηγεί σε υποβάθμιση
του κολλαγόνου τύπου IV της βασικής μεμβράνης. Τα στοιχεία αυτά αποδεικνύουν ότι το μέλι ενεργοποιεί τα κερατινοκύτταρα και υποστηρίζει τα ευρήματα ότι το μέλι μπορεί να επιταχύνει την διαδικασία επούλωσης των πληγών.

H επούλωση πληγών είναι μια πολύπλοκη διαδικα-
σία που περιλαμβάνει διάφορες κυτταρικές, εξωκυτ-
ταρικές ουσίες και κύτταρα (κερατινοκύτταρα, ινο-
βλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα,μαστοκύτταρα, νευρικά κύτταρα και υποτύπους λευκοκύτταρων), που συμμετέχουν με διαφορετικό τρόπο στις τρείς φάσεις που αλληλεπιδρούν (φλεγμονή,κυτταρικός πολλαπλασιασμός και ανάπλαση ιστών).

Ανώριμα κερατινοκύτταρα παράγουν μεταλλοπρω-

τεϊνάση (MMPs) και πλασμίνη που επιτρέπει το δια-

χωρισμό τους από τη βασική μεμβράνη και επίσης

διευκολύνει τη μετανάστευση τους. Κερατινοκύτταρα

παράγουν σχετικά υψηλές ποσότητες μεταλλοπρω-

τεϊνάσης-9 (MMP-9), και αυτή η παραγωγή μπορεί να

είναι επιπλέον αυξορυθμιζόμενη από TGF-β, TNF-α

και IL-1β. MMP-9 (gelatinase Β) είναι μια ψευδάρ-

γυρο εξαρτώμενη ενδοπεπτιδάση, που εμπλέκεται

στην πρωτεολυτική αποδόμηση των matrix πρω-

τεΐνων, όπως ο τύπος ΙΙΙ και IV κολλαγόνων και της

ελαστίνης. Ορισμένες κυτταροκίνες, κυρίως η IL-1β

και TNF-α, μπορούν επίσης να προκαλέσουν την

παραγωγή του κερατινοκυτταρικού αυξητικού παρά-

γοντα FGF-7, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να

προωθήσει έμμεσα εκ νέου επιθηλιοποίηση.

Ιστορικά, το μέλι έχει χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία

ευρέος φάσματος τραυματισμών, συμπεριλαμβανο-

μένων εγκαυμάτων και ελκών.

Στοιχεία από μελέτες σε ζώα και πειράματα, έχουν

δείξει ότι το μέλι, μπορεί να επιταχύνει την επού-

λωση των πληγών. Θετικά αποτελέσματα για το μέλι

στη θεραπεία πληγών, η οποία συνοψίζεται σε μια

πρόσφατη ανασκόπηση, έχουν αναφερθεί από τυχαί-

ες κλινικές μελέτες, στις οποίες συμμετείχαν πάνω

από 2000 άτομα. Από την άλλη πλευρά, η ποιότητα

των αναφερομένων δοκιμών ήταν μεταβλητή και τα

αποδεικτικά στοιχεία μέχρι σήμερα τεκμηριώνουν το

μέλι ως μία θεραπεία ήπιων και μέτριων, επιφανει-

ακών και βαθύτερων εγκαυμάτων. Συγγραφείς της

ανασκόπησης ισχυρίζονται ότι δεν υπάρχουν επαρκή

στοιχεία για να καθοδηγήσουν σε κλινική εφαρμογή

για άλλου είδους πληγές.

Θεωρείται ότι το υψηλό ιξώδες, το όξινο pH και το

υπεροξείδιο του υδρογόνου που υπάρχουν στο μέλι,

καθώς και η υψηλή ωσμωτικότητα και περιεκτικότητά

του σε θρεπτικά συστατικά, προάγουν την επούλωση

του τραύματος. Ωστόσο, περαιτέρω μηχανισμοί της

δράσης που σχετίζονται με τις επιδράσεις του μελιού

στην επούλωση των τραυμάτων παραμένουν αινιγμα-

τικά.

Τα τελευταία χρόνια, αρκετές μελέτες έχουν επικε-

ντρωθεί στις αντιφλεγμονώδεις δράσεις του μελιού

και το δυναμικό του ρόλο στην διέγερση της ανοσο-

ποιητικής απάντησης. Ανοσορυθμιστικές επιπτώσεις

έχουν δείξει in vitro την απελευθέρωση κυτταροκι-

νών από κυτταρικές σειρές μονοκυττάρων και από

ανθρώπινα μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος

μετά από επώαση με μέλι. Επιπλέον, οι Tonks et al

έχουν προτείνει ότι ένα συστατικό 5,8 kDa που απο-

μονώθηκε από το μέλι Manuka είναι υπεύθυνο για

την TNF-α επαγωγή σε ανθρώπινα μονοκύτταρα

μέσω Toll-like υποδοχέων (TLR) 4. Έχουμε δείξει στο

παρελθόν ότι το μέλι ακακίας είναι σε θέση να ενι-

σχύσει την TNF-α έκκριση από τα μακροφάγα ποντι-

κών, ενώ το αποπρωτεϊνισμένο μέλι δεν έχει καμία

επίδραση στην απελευθέρωση του TNF-α. Αυτό ση-

μαίνει ότι η περιεκτικότητα του μελιού σε πρωτεΐνες,

κυρίως στην 55 kDa γλυκοπρωτεΐνη, η οποία είναι

και η κύρια πρωτεΐνη του βασιλικού πολτού (MRJP1),

καθώς και το μέλι, μπορεί να ευθύνονται για την

ανοσορυθμιστική δράση του μελιού. Επιπλέον, έχει

αναφερθεί ότι και ορισμένες άλλες βιολογικές επι-

πτώσεις μπορεί επίσης να αποδοθούν στην MRJP1.

Ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των ηπατοκυττάρων

και τα πεπτίδια που προέρχονται από την MRJP1 δι-

αθέτουν ισχυρή αντιυπερτασική και αντιμικροβιακή

δράση. Σε μια πολύ πρόσφατη μελέτη, μια ένωση με

μοριακό βάρος (MW) 261 από μέλι της ζούγκλας φά-

νηκε να έχει χημειοτακτική δράση για τα ουδετερόφι-

λα καθώς και αντικαρκινική δράση. Εκτός από τα ευ-

ρήματα αυτά, έχει αποδειχτεί in vitro ότι οι επιδράσεις

που παρατηρούνται σε κύτταρα του ανοσοποιητικού

συστήματος δεν προκύπτουν κατ ‘ανάγκη από την

παρουσία μιας νέας ανοσορυθμιστικής ουσίας, αλλά

μπορεί να αποδοθούν αποκλειστικά στην ενδοτοξίνη

που περιέχεται στο μέλι. Ο σκοπός της παρούσας με-

λέτης ήταν να διερευνήσει τις επιδράσεις του μελιού

και της κυρίαρχης MRJP1 πρωτεΐνης του ως ισχυρό

θεραπευτικό μέσο για τα πρωταρχικά ανθρώπινα κε-

ρατινοκύτταρα, τα οποία διαδραματίζουν καθοριστικό

ρόλο στις διαδικασίες επούλωσης των πληγών στο

δέρμα. Έχουμε αποδείξει ότι το μέλι είναι σε θέση να

προκαλέσει την έκφραση ορισμένων κυτταροκινών

(TNF-α, IL-1β και TGF-β) και MMP-9 mRNA σε αν-

θρώπινα κερατινοκύτταρα. Καθαρή MRJP1 διεγείρει

επίσης την δημιουργία της mRNA έκφρασης κυττα-

ροκίνης. Ωστόσο, το αποτέλεσμα αυτό δεν ήταν τόσο

ισχυρό όσο αυτό του μελιού.

Μέθοδοι

To Μέλι

Μέλι ακακίας αγοράστηκε από το μελισσοκομείο του

κ. Peter Irha (Σλοβακία). Η επιθυμητή ποσότητα του

μελιού ζυγίστηκε και αραιώθηκε σε PBS. Το διάλυμα

του μελιού έγινε πάνω από 50% (w / v) και αποστει-

ρώθηκε με διήθηση. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν

με 1% διάλυμα μελιού. Το περιεχόμενο της ενδοτοξί-

νης στο διάλυμα μελιού δοκιμάστηκε σε μια θολωσι-

μετρική μέθοδο, LAL, ακολουθώντας τις οδηγίες του

κατασκευαστή . Προκειμένου να αποφευχθεί πιθανή

παρεμβολή του δείγματος μελιού με LAL δοκιμή,

συγκεντρώσεις ενδοτοξίνης επιβεβαιώθηκαν μέσω

διαδικασίας εμβολιασμού.

Καθαρισμός της κύριας πρωτεΐνης1 του βασιλικού πολτού

Βασιλικός πολτός (RJ) (Ινστιτούτο Μελισσοκομίας,

Liptovsky Hradok, Slovakia) ομογενοποιήθηκε σε

συγκέντρωση 10 mg / ml σε διάλυμα 0,05 m HEPES,

pH 8,3 (Διάλυμα Α). Εξαγωγή των πρωτεϊνών πραγ-

ματοποιήθηκε, το υπερκείμενο υγρό συλλέχθηκε

από τον RJ, φιλτραρίστηκε και φορτώθηκε σε HiTrap

DEAE Sepharose FF column όπου η ροή διαμέσου

της στήλης συλλέχθηκε και εφαρμόστηκε σε HiTrap

Heparin. Το έκλουσμα μετρήθηκε στα 280 nm. Τα

κλάσματα που περιείχαν MRJP1 αναλύθηκαν και

συμπυκνώθηκαν. Το λαμβανόμενο δείγμα εφαρμό-

στηκε σε στήλη και καθορίστηκε η καθαρότητα του

παρασκευασμένου MRJP1 σε ρυθμιστικό διάλυμα. Η

συγκέντρωση πρωτεϊνών και η αλβουμίνη ορού βο-

οειδών, χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεΐνη αναφοράς.

Δύο συγκεντρώσεις καθαρού MRJP1 (5 και 25 μg /

ml) χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη.

(SDS-NuPAGE)

Η σύνθεση της πρωτεΐνης διαφόρων δειγμάτων υπο-

λογίστηκε με SDS-NuPAGE. Τα δείγματα χωρίστηκαν

σε NuPAGE Bis- Tris 4-12% 1 mm gel. Πρωτεϊνικές

ζώνες ανιχνεύτηκαν μετά από χρώση.

Απομόνωση των κερατινοκυττάρων

Ακροβυστία που λήφθηκε από περιτομή υγιών παι-

διών χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση των

πρωταρχικών κερατινοκυττάρων. Ιστός του δέρμα-

τος κόπηκε σε μικρά κομμάτια, επωάστηκε, η επι-

δερμίδα χωρίστηκε από το δέρμα, τα κύτταρα διηθή-

θηκαν, πλύθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε ελεύθερο

ορό κερατινοκυττάρου-συγκεκριμένου μέσου ανά-

πτυξης, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Η καθαρότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με ανο-

σοϊστοχημικές ανιχνεύσεις κυτοκερατίνης.

Διέγερση των κερατινοκυττάρων

Πρωτογενείς καλλιέργειες κερατινοκυττάρων επωά-

στηκαν με μέλι και MRJP1. Κατά τον έλεγχο, κερα-

τινοκύτταρα επωάστηκαν σε μέσο χωρίς διεγερτικά.

Στα κύτταρα αυτά στη συνέχεια προκλήθηκε άμεση

λύση στις πλάκες τους και το λύμα φυλάχθηκε πριν

την RT-qPCR.

Δοκιμασία Γαλακτικής Αφυδρογονάσης

Η κυτταροτοξική δράση του μελιού και της MRJP1

στα κερατινοκύτταρα μετρήθηκε με δοκιμασία σετ

γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH), σύμφωνα με το

πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα αποτελέσματα

εκφράστηκαν ως ποσοστό κυτταροτοξικότητας και

υπολογίστηκαν σύμφωνα με εξίσωση του κατασκευ-

αστή.

Real-Time PCR

Ολικό RNA συλλέχτηκε από κερατινοκύτταρα και

cDNA λήφθηκε από αντίστροφη μεταγραφή. Περίπου

10 ng των cDNA χρησιμοποιήθηκε ανά αντίδραση

για να ενισχύσει τον TNF-α, IL-1β, TGF-β και 28S

rRNA αντιγραφές. Η γονιδιωματική ενίσχυση του

RNA έγινε εις διπλούν με iCycler real- time σύστημα

ανίχνευσης. Τιμές CT που προκύπτουν με τα διάφορα

ερεθίσματα ομαλοποιήθηκαν στο 28S rRNA και εκ-

φράστηκαν ως σχετικές μονάδες (RU) στο μηχάνημα

που έλαβε τα δείγματα.

Ανοσοϊστοχημεία

Υγιείς ακροβυστία κόπηκαν σε κομμάτια και επωά-

στηκαν με μέλι και MRJP1 σε ορό χωρίς κερατινο-

κύτταρα μέσης ανάπτυξης. Ο ιστός έπειτα τοποθετή-

θηκε σε παραφορμαλδεΰδη και ενσωματώθηκε σε

κερί παραφίνης. Τομές παραφίνης ιστού κόπηκαν

και, μετά την αποξήρανση, τμήματα αποκηρώθη-

καν, ενυδατώθηκαν και μπήκαν σε μεθανόλη για να

μπλοκάρουν την ενδογενή υπεροξειδάση. Μια μέθο-

δος ανάκτησης αντιγόνου χρησιμοποιήθηκε για την

ανίχνευση της MMP-9. Στη συνέχεια τμήματα ξεπλύ-

θηκαν και επωάστηκαν με αντι-ανθρώπινο MMP-9

αντίσωμα κουνελιού και μονοκλωνικό αντίσωμα

ποντικού έναντι ανθρώπινου κολλαγόνου τύπου IV.

Σε δεύτερη φάση, οι διαφάνειες πλύθηκαν ξανά και

επωάστηκαν με βιοτινισμένο-κουνέλι αντίσωμα πο-

ντικο ή βιοτίνη χοίρων αντι-κουνελιού αντισώματα,

ακολουθούμενες από ανοσοχρώση σύμφωνα με τις

οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή με

τυπικό σφάλμα (SEM). Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν

στατιστικά με παραμετρικό paired Student’s t-test

για να διαπιστωθεί αν υπήρχαν διαφορές μεταξύ των

ομάδων. Π-τιμές μικρότερες του 0,05 θεωρήθηκαν

σημαντικές.

Αποτελέσματα

Καθαρισμός της κύριας βασιλικής πρωτεΐνης 1

από βασιλικό πολτό

Αρκετές στήλες χρησιμοποιήθηκαν στον καθαρισμό

της MRJP1 από RJ. HiTrap DEAE δια μέσου ροής

κλασματοποιήθηκε σε μια HiTrap στήλη ηπαρίνης.

Τα καθαρισμένα κλάσματα συγκεντρώθηκαν και

αναλύθηκαν. Το συμπυκνωμένο δείγμα καθαρίστηκε

περαιτέρω σε στήλη μοριακής διήθησης. Δύο σημα-

ντικά καθαρά κλάσματα εντοπίστηκαν. Τα κλάσματα

αυτά συγκεντρώθηκαν και στη συνέχεια αναλύθηκαν

σε SDS-NuPAGE. Μείωση SDS-NuPAGE ανάλυσης

έδειξε 55 kDa και 49 kDa πρωτεΐνες ζώνες, αντίστοι-

χα. Η 55 kDa πρωτεΐνη αντιπροσωπεύει την MRJP1

και η 49 kDa πρωτεΐνη αντιστοιχεί στη MRJP2.

Γαλακτική αφυδρογονάση και μέθοδος limulus

amebocyte lysate

Η κυτταροτοξική δράση του μελιού και της MRJP1

στα κερατινοκύτταρα μετρήθηκε με κιτ προσδιορι-

σμού της LDH. Ως θετικός μάρτυρας, χρησιμοποιή-

θηκε το Triton X-100 σε συγκέντρωση 2% (v / v) ώστε

να προκληθεί ολική λύση των πρωτογενών κερατι-

νοκυττάρων. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από

την ανάλυση της LDH αποκάλυψαν ότι το ποσοστό

της κυτταροτοξικότητας ήταν κάτω από 5% ανεξάρ-

τητα από το αν χρησιμοποιήθηκε μέλι ή MRJP1. Ούτε

το μέλι ούτε η MRJP1 έδειξε κυτταροτοξική επίδραση

των πρωτογενών κερατινοκυττάρων στις υπό δοκι-

μή συγκεντρώσεις. Το διάλυμα μελιού ακακίας που

χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη περιείχε 0,42 ng

/ ml του λιποπολυσακχαρίτη (LPS), όπως καθορίζε-

ται από τη δοκιμή LAL. Εμβολιασμός του διαλύματος

μελιού με ενδοτοξίνη κατάφερε την αποδεκτή ανά-

καμψη (112%).

Επίδραση του μελιού και της κύριας πρωτεΐ-

νης 1 του βασιλικού πολτού στην έκφραση του

mRNA των προφλεγμονωδών κυτταροκινών

και του TGF-β

Τεχνική ανοσοφθορισμού για την απεικόνιση των

ινών κερατίνης έδειξε ότι το 100% των κυττάρων

σε καλλιέργεια ήταν θετικές και καμία επιμόλυνση

ινοβλαστών δεν είχε συμβεί. Το μέλι ακακίας προ-

κάλεσε μία υπεραυξημένη ρύθμιση των IL-1β και

TGF-β mRNA με αυξημένη έκφραση 12-φορές και

οκτώ φορές, αντίστοιχα. Από την άλλη πλευρά, η

έκφραση mRNA του TNF-α μετά από επώαση των

κερατινοκυττάρων με μέλι ήταν υπεραυξημένη μόλις

δύο φορές. Είναι ενδιαφέρον, σε συγκέντρωση των

25 μg / ml, MRJP1 αύξησε επίσης τα επίπεδα της

έκφρασης του TNF-α mRNA στα πρωτογενή κερα-

τινοκύτταρα. Επιδράσεις στην έκφραση της IL-1β και

του TGF-β, δεν ήταν στατιστικά σημαντική, λόγω της

υψηλής μεταβλητότητας των επιπέδων αντιγραφής,

αλλά μια ανοδική τάση στην mRNA έκφραση της IL-

1β και του TGF-β, παρατηρήθηκε μετά από θεραπεία

με MRJP1 σε καθένα από τα τέσσερα δείγματα ιστού

και στις δύο συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν (5 και

25 μg / ml).

Επαγωγή του MMP-9 mRNA και της πρωτεϊνι-

κής έκφρασης στα κύτταρα και στους ιστούς,

αντίστοιχα

Σε αντίθεση με τις επιπτώσεις της MRJP1, το μέλι ενι-

σχύει σημαντικά την έκφραση της MMP-9 mRNA στα

πρωτογενή κερατινοκύτταρα. Επιπλέον, η επώαση

τμήματος ανθρώπινου δέρματος με μέλι συνδέθηκε

με την αυξημένη έκφραση της MMP-9, όπως απο-

καλύφθηκε από την ανοσοϊστοχημεία. MMP-9 χρώ-

ση ήταν περισσότερο εμφανής στην επιδερμίδα και

ιδιαίτερα κοντά στην μεμβράνη. Ωστόσο, όπως με τα

αποτελέσματα του mRNA, η MRJP1 δεν αύξησε την

MMP-9 παραγωγή στο δέρμα, ακόμη και στην υψη-

λότερη συγκέντρωση (25 μg / ml).

Ανοσοϊστοχημική χρώση του κολλαγόνου τύπου

IV στο ανθρώπινο δέρμα

Το υπόστρωμα της MMP-9 είναι το κολλαγόνο τύπου

IV. Βρήκαμε μια σχετική μείωση του ποσού του κολ-

λαγόνου τύπου IV στη βασική μεμβράνη και γύρω

από τα αιμοφόρα αγγεία μετά την επώαση του δέρ-

ματος με μέλι για 24 ώρες. Όπως ήταν αναμενόμενο,

MRJP1 σε συγκέντρωση των 25 μg / ml, είχαν πολύ

μικρή ή καθόλου επίδραση στο κολλαγόνο τύπου IV.

Συζήτηση

Μέχρι τώρα, δεν υπήρξε καμία μελέτη που να ερευ-

νά την επίδραση του μελιού στα κερατινοκύτταρα ή

άλλους τύπους κυττάρων, εκτός από τα μονοκύτταρα

και τα μακροφάγα. Παράλληλα με τα μακροφάγα, τα

κερατινοκύτταρα παίζουν αναμφισβήτητα ένα βασικό

ρόλο στην παραγωγή πολλών από τις προφλεγμονώ-

δεις κυτοκίνες, οι οποίες διαδραματίζουν σημαντικό

ρόλο στην πρώτη φάση της διαδικασίας επούλωσης

των τραυμάτων.

Ενδεχομένως θα μπορούσαν να ευδοκιμήσουν ή να

εμφανιστούν ξανά στις εξής φάσεις.

Το μέλι είναι ένα παχύρρευστο, συμπυκνωμένο διά-

λυμα ζάχαρης που προέρχεται από το νέκταρ που

συγκεντρώθηκε και τροποποιήθηκε από την μέλισ-

σα, Apis meliffera. Το μέλι έχει χρησιμοποιηθεί από

τους αρχαίους χρόνους ως θεραπεία στη φροντίδα

του τραύματος. Αν και δεν υπάρχουν αρκετά στοιχεία

για να συστήσουμε ένα είδος μελιού σε άλλο, το μέλι

Manuka από την Αυστραλία και τη Νέα Ζηλανδία

έχει χρησιμοποιηθεί ως κύριο σε πολλές ερευνη-

τικές μελέτες. Το μέλι που προέρχεται από τα άνθη

Leptosermum scoparium (Manuka) διαπιστώθηκε

να έχει επιπρόσθετα θεραπευτικά πλεονεκτήματα

σε σχέση με άλλα μέλια. Το κύριο πλεονέκτημα του

Manuka μελιού είναι ότι οι πηγές των άνθεων του

αυξάνουν την αντιβακτηριδιακή του δράση, ακόμη

και ενάντια στη μεθικιλλίνη –ανθεκτική στον χρυσί-

ζων σταφυλόκοκκο (MRSA). Μέλι ακακίας που συλ-

λέχθηκε στη Σλοβακία χρησιμοποιήθηκε στην πα-

ρούσα μελέτη. Έχει τεκμηριωθεί ότι το μέλι ακακίας

είναι σε θέση να τονώσει την TNF-α έκκριση από τα

μακροφάγα ποντικού και έχει πιθανές ανοσορρυθμι-

στικές ιδιότητες.

Η περιεκτικότητα του μελιού σε πρωτεΐνες είναι με-

ταβλητή και εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το είδος

των μελισσών, από τα διαφορετικά φυτά της περι-

οχής και από τη γύρη των λουλουδιών. Το μέλι πε-

ριέχει πρωτεΐνες μόνο στο λεπτό, 0,1 έως 0,5% των

ποσοτήτων.

MRJP1 παρουσιάζεται σε RJ σε διάφορες μορφές:

ως μονομερές (55 kDa), ως μορφή ολιγομερών (420

kDa) και ως αδιάλυτη στο νερό μορφή που αντιπρο-

σωπεύει την πολυπλοκότητα της με τα λιπαρά οξέα.

Επιπλέον, μία 350 kDa γλυκοπρωτεΐνη, έχει περιγρα-

φεί σε RJ το οποίο αποτελείται από έξι υπομονάδες,

κάθε μία με την ίδια N-τερματική αλληλουχία, ως μο-

νομερές MRJP1 από RJ και μέλι και ακόμη ένα άλλο

280 kDa ολιγομερές σύνθετο της MRJP1, έχει απο-

μονωθεί από το μέλι. Δεν είναι σαφές ποιοι παράγο-

ντες επηρεάζουν τον ολιγομερισμό της MRJP1 ή αν

διαφέρει ανάλογα με την πηγή του RJ και του μελιού,

ένας καθοριστικός παράγοντας θα μπορούσε να είναι

οι διαφορές στην γλυκοζυλίωση των διαφορετικών

ειδών μελισσών. Ωστόσο, οι βιολογικές δράσεις της

MRJP1 μπορεί να εξαρτώνται από την κατασκευαστι-

κή της δομή . Ως εκ τούτου, εμείς το απομονώσαμε

ως μονομερές.

Κατά τη διάρκεια του καθαρισμού μελιού MRJP1 από

RJ πολλές στήλες χρησιμοποιήθηκαν για να αποκτή-

σουμε πρωτεΐνη υψηλής καθαρότητας. Προκειμένου

να εξαλείψουμε άλλες πρωτεΐνες του RJ, χρησιμο-

ποιήσαμε μία Sepharose DEAE στήλη, Heparin στή-

λη και Superdex στήλη μοριακής διήθησης.

Εκτός από τις ευεργετικές του ουσίες, το φυσικό

μέλι μπορεί να περιέχει βακτηριακές προσμείξεις

, κυρίως LPS. Ανάλογα με τον τύπο των κυττάρων

και τις συνθήκες καλλιέργειας, LPS μπορεί να έχει

διάφορες επιπτώσεις στη λειτουργία των κυττάρων

και στην ανάπτυξή τους. Τα μονοπύρηνα κύτταρα,

ιδιαίτερα τα μονοκύτταρα, είναι εξαιρετικά ευαίσθη-

τα στην ενδοτοξίνη. Τα μονοκύτταρα ανιχνεύουν τους

βακτηριακούς συζευκτές μέσω TLRs, δηλαδή των

TLR-2 και TLR-4. Ωστόσο, η έκφραση των TLRs από

κερατινοκύτταρα δεν είναι πλήρως κατανοητός. TLRs

φαίνεται να εκφράζονται σε πολύ χαμηλά επίπεδα,

αλλά η παρουσία των λειτουργικών TLRs 3-5 και 9

έχει αποδειχθεί από την επαγωγή των χημοκινών,

κυτταροκινών και άλλων μορίων που σχετίζονται με

τη φλεγμονή σε καλλιεργημένα πρωτογενή κερατινο-

κύτταρα. Έχει διαπιστωθεί ότι τα ανθρώπινα κερατι-

νοκύτταρα εκφράζουν CD14 και TLR4 mRNA και ότι

η έκφραση τους είναι αυξημένη μετά την προσθήκη

100 ng / ml LPS σε καλλιεργημένα κύτταρα. Επιπλέ-

ον, η βακτηριακή LPS σε συγκεντρώσεις από 1-10 ng

/ ml, έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει τη μετανάστευση

των ανθρώπινων κερατινοκυττάρων, χωρίς να επη-

ρεάζει τη βιωσιμότητα ή να αυξάνει την απόπτωση.

Η αναστολή της μετανάστευσης είναι συγκεκριμένη

στα βακτηριακά είδη: παρατηρήθηκαν διαφορές με-

ταξύ των αποτελεσμάτων LPS από Escherichia coli

και Pseudomonas aeruginosa. Η συγκέντρωση του

LPS σε 1% (w / v) από δείγμα μελιού ακακίας που

χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη ήταν πολύ χα-

μηλό (0,42 ng / ml). Αυτό είναι σύμφωνο με τα απο-

τελέσματα που αναφέρθηκαν πρόσφατα δείχνοντας

ότι η συγκέντρωση των ενδοτοξινών σε 1% διάλυμα

φυσικού μελιού ήταν λιγότερη από 0,7 ng / ml. Σε

αυτή τη βάση , καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η

παρατηρούμενη ανοσορυθμιστική δράση του μελιού

σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα δεν οφειλόταν στην

παρουσία των βακτηρίων LPS. Επιπλέον, LPS σε

συγκέντρωση 10 ng / ml, δεν προκάλεσε την mRNA

έκφραση των κυτταροκινών στα ανθρώπινα κερατι-

νοκύτταρα (τα στοιχεία δεν εμφανίζονται).

Οι ευεργετικές ιδιότητες του μελιού έχουν καταγρα-

φεί όχι μόνο στους ανθρώπους, αλλά και σε ζωικά

μοντέλα. Το μέλι προκαλεί ποσοστιαία τη διέγερση

της αγγειογένεσης, κοκκοποίησης και επιθηλιοποίη-

σης σε ζώα και παρόμοιες επιδράσεις στον άνθρωπο

θα μπορούσαν να εξηγήσουν τα ευρήματα σε κλι-

νικές μελέτες πως το μέλι επιταχύνει τη διαδικασία

επούλωσης. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι το

μέλι αποτελεί πηγή βιοενεργών ενώσεων, των οποί-

ων η αναγνώριση θα μπορούσε να αποκαλύψει νέες

θεραπευτικές δυνατότητες για τη θεραπεία πληγών

τόσο σε ανθρώπους όσο και σε ζώα.

Ένας από τους πιθανούς υποψηφίους, που μπορεί

να λάβει μέρος στην επούλωση των πληγών, είναι

η κυρίαρχη ανοσορυθμιστική πρωτεΐνη του μελιού,

MRJP1, που εμφανίζεται στο μέλι. Εμείς αποκα-

λύπτουμε ότι δεν έχει σημαντικές διεγερτικές επι-

δράσεις στην επαγωγή των mRNA κυτταροκινών

(εξαιρουμένων των TNF-α) και της MMP-9 στα κερα-

τινοκύτταρα, αλλά μια ανοδική τάση στην mRNA έκ-

φραση παρατηρήθηκε. Επιπλέον, οι συγκεντρώσεις

της MRJP1 που αναφέρθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν

υψηλότερες από ότι η MRJP1 συγκέντρωση σε 1% (w

/ v) διάλυμα μελιού. Γι ‘αυτό εικάζουμε ότι ένας άλ-

λος παράγοντας (ες) και / ή μηχανισμό (οι) εκτός από

την MRJP1 εμπλέκονται στη διαδικασία επούλωσης.

Προτείνουμε ότι το pH, η απελευθέρωση του υπε-

ροξειδίου του υδρογόνου και επιπρόσθετα στοιχεία

μπορούν να μεσολαβήσουν θετικά στις ρυθμιστικές

δράσεις του μελιού για την επούλωση των πληγών.

Η επαγωγή του TNF-α mRNA από MRJP1 σε συγκέ-

ντρωση 25 μg / ml και το μέλι έχουν αυξήσει το επί-

πεδο του TNF-α mRNA έκφραση μόλις δύο φορές.

Από την άλλη πλευρά, το μέλι προκαλεί 8-πλάσια και

10-πλάσια αύξηση του TGF-β και της IL-1β στην έκ-

φραση του mRNA, αντίστοιχα. Μια πιθανή εξήγηση

για την χαμηλότερη παρατηρούμενη επαγωγή της

TNF-α έκφρασης με μέλι βρίσκεται στην διάρκεια της

θεραπείας. Οι Tonks et al έχουν αναφέρει στο παρελ-

θόν ότι η έκφραση της TNF-α πρωτεΐνης έφθασε στο

ανώτατο επίπεδο μετά από 3 ώρες διέγερσης με 1%

μέλι Manuka σε μονοκυτταρική γραμμή καλλιέργει-

ας, ενώ η IL-1β πρωτεΐνη κορυφώθηκε μετά από 18

ώρες διέγερσης. Μπορεί να είναι ότι για τη δοκιμασία

της TNF-α mRNA πρέπει να στραφούμε σε νωρίτερο

χρονικό σημείο.

Η διέγερση της MMP-9 έκφρασης αποδείχθηκε στο

δέρμα μετά από επώαση με μέλι. Το μεγαλύτερο μέ-

ρος της χρώσης συνδέθηκε με επιδερμικά κερατι-

νοκύτταρα. Χρώση επίσης εντοπίστηκε στην βασική

στιβάδα των κερατινοκυττάρων καθώς και σε ενδο-

δερμικές αδενικές δομές. Η MMP-9 είναι σε θέση να

ενεργοποιήσει τις κυτοκίνες όπως TGF-β, IL-1β και

TNF-α από τις προ-μορφές τους, και έτσι, να τονωθεί

η δική της έκκριση από τα κερατινοκύτταρα. Το μέλι

προωθεί επίσης την αποδόμηση του κολλαγόνου τύ-

που IV στη βασική μεμβράνη. Επιπλέον, το μέλι προ-

άγει την έκκριση της MMP-9 σε ανενεργή μορφή που

αποδείχτηκε με genatinolytic zymography.

Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι

το μέλι ενεργοποιεί τα ανθρώπινα κερατινοκύτταρα,

με την επανά-ρύθμιση της έκφρασης συγκεκριμέ-

νων κυτταροκινών (TNF-α, IL-1β και TGF-β) και

MMP-9. Έχουμε αποδείξει ότι το μέλι προάγει ση-

μαντικά την υποβάθμιση του κολλαγόνου τύπου IV,

μέσω της MMP-9 διέγερσης του δέρματος.

Μέλι και MRJP1 σε συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν

είναι σε θέση να προκαλέσουν τον πολλαπλασιασμό

των ανθρώπινων κερατινοκυττάρων, αλλά απαιτού-

νται περαιτέρω μελέτες για να αποκαλύψουν παρά-

γοντες και μοριακούς μηχανισμούς που συμμετέ-

χουν στην ενεργοποίηση των κερατινοκυττάρων από

το μέλι. Τέτοια δεδομένα μπορεί να έχουν τη δυνατό-

τητα να ενεργήσουν ως νέοι θεραπευτικοί παράγο-

ντες και στόχοι για τη θεραπεία των πληγών.

Συντομογραφίες:

MRJP1 κύρια πρωτεΐνη βασιλικού πολτού 1

RJ βασιλικός πολτός

MMP matrix μεταλλοπρωτεϊνάσης

LPS λιποπολυσακχαρίτη

TLRs διοδίων, όπως υποδοχείς.
(Περιοδικό Μελίαμα)